Посилення польських утисків і католицької експансії в останні десятиліття XVI ст. стимулювало подальшу консолідацію українського народу, проте вже не так під егідою своїх князів (які масово приймали католицизм і входили до складу вищої аристократії Польсько-Литовського князівства), як під егідою запорізького козацтва. Польська влада мусила юридично визнати козацтво. Проте козачий статус офіційно визнавався за незначною кількістю козаків. Лише за тими, хто входив до реєстру (списку) осіб і перебував на службі в Речі Посполитій, одержуючи від корони відповідну платню.
Формування реєстрового козацтва починалося з універсалу короля Сигізмунда II Августа від 1572 р., за яким на державну військову службу був прийнятий загін у складі 300 козаків. У 1578 р. король Стефан Баторій збільшив реєстр до 500 чоловік. Ці козаки офіційно звільнялися з-під юрисдикції землевласників і старост, мали свій військовий суд і одержували за службу платню. Для утримання арсеналу і шпиталю з будинком інвалідів та літніх (хоча мало хто з козаків доживав до старості) їм передавалося містечко Трахтемирів. Реєстровому козацькому війську України надавалися військові регалії: малинова хоругва (стяг), армійська печатка, бунчук, гетьманська булава, бубони і труби.
Консолідації козацтва наприкінці XVI ст., особливо в протистоянні Берестейській церковній унії 1596 р., зростає активність українського міщанства, шляхти і духівництва, які боролися за православний просвітницький розквіт України. В 70 — 90-ті роки XVI ст. вони почали активну діяльність щодо збереження своєї релігійно-духовної ідентичності, добре розуміючи значення системи шкільної освіти і друкарства.
У другій половині XVI ст. ці два напрями — козацьке і просвітницьке — були ще слабко пов'язані між собою. Вони розвивалися ніби паралельно, у різних площинах, хоч окремі випадки вступу до лав козаків високоосвічених випускників Острозької школи добре відомі. Серед них, зокрема легендарний отаман запорозьких козаків Северин Наливайко — брат православного вченого, викладача Острозької академії Дем'яна Наливайка. Але провідна роль у консолідації найпотужніших сил українського народу для рішучої боротьби за його права і національні інтереси належить славнозвісному гетьману Війська Запорозького Петру Кононовичу Конашевичу-Сагайдачному.
Петро Конашевич, більш відомий за прізвиськом, яке дали йому запорожці, — Сагайдачний, — одна зі знакових постатей староукраїнської історії. Упродовж життя йому доводилося боротися на Чорному морі і біля стін Москви, разом із поляками перепиняти туркам шлях у Європу і підновлювати православну ієрархію на українсько-білоруських землях. Як справжній козак він на перше місце ставив особисту свободу, православну віру і запорозьке братство, що міцніло в протистоянні татарсько-турецькій агресії і польсько-католицькому тиску. Про Петра Сагайдачного складалися пісні, які й сьогодні співають в Україні. Про молоді роки П.Конашевича відомо мало. Народився він близько 1570 р. у селі Кульчицях поблизу містечка Самбір неподалік від Львова в православній шляхетській (дворянській) сім'ї. Після Львівської, або якоїсь іншої братської школи він вирушає вчитися на Волинь в Острозький слов'яно-греко-латинський колегіум (академію), який був під патронатом київського воєводи князя Костянтина-Василя Острозького.
Після закінчення колегіуму молодий Петро Конашевич займався у Києві педагогічною практикою. Зокрема відомо, що якийсь час він був учителем у родині міського судді Яна Аксака. Втім, мирна праця на ниві народного просвітництва явно не відповідала його енергійному і рішучому характеру. Жорстока боротьба з татарськими навалами, яку вели запорозькі козаки і старости прикордонних міст-фортець (Черкас, Чигирина, Умані), не припинялася. У той же час, у зв'язку з проголошенням у 1596 р. церковної Берестейської унії, обстановка в Україні різко загострилася. Православна шляхта зберігала вірність східним обрядам, і натхнення закликам К.Острозького, готова була зі зброєю в руках боротися за збереження віри. Петро Конашевич не міг залишатися осторонь від цих епохальних для України подій. У цей час школою лицарської мужності для православної української молоді була організація, що виникла за Дніпровськими порогами (звідси і назва — Запорозька) Січ. Біля її джерел у середині XVI ст. стояв уславлений князь-отаман Дмитро Вишневецький. Це було створене на демократичних засадах православне військове братство, яке деякі дослідники схильні порівнювати із західними лицарськими орденами. Жінок на Січ не пускали, а всі основні питання вирішувалися на загальних зборах котків. Стати членом цієї співдружності могла людина будь-якого звання і походження. Умовами прийому були лише вірність православ'ю і доведена в бою мужність. Січове козацтво, що заступило Україну від татарсько-турецьких військ, шаходилося поза межею досяжності польської адміністрації. Тут збирали- си ті, хто не бажав миритися з насаджуваними поляками порядками — від шатних православних шляхтичів до холопів. Потрапляючи на Січ, усі ставили рівними, а просування по військовій службі визначалося винятково особистими якостями людини.
Запорозьке козацтво ще з часів Байди Вишневецького прославилося і міливими походами на Кримське ханство і турецькі міста-фортеці Північного Причорномор'я. З кінця XVI ст. Запоріжжя стає також центром Гюротьби православного населення України проти польсько-католицької кспансії. Звідси на боротьбу з королівськими військами виступали загони К.Косинського і С.Наливайка. Слава про Січ досягала Західної Європи, про що, зокрема, свідчить посольство в 1594 р. німецького імператори до запорозьких козаків. Його очолив Еріх Лясота, маючи на меті налагодити з запорожцями стосунки для спільної боротьби з могутньою Османською імперією. Близько 1600 р. П.Конашевич потрапляє на Запорозьку Січ і швидко стає одним із визнаних козацьких лідерів. Йому близько 30 років і, мабуть, він уже мав достатній бойовий досвід. Проте де і з ким йому доводилось воювати в молоді роки залишається нез'ясованим. Він міг брати участь і в боротьбі з татарами, що продовжували набіги на прикордонні українські землі, і в антипольських козацьких виступах 90-х років XVI ст. Але справжня слава прийшла до нього саме на Січі й в історію він увійшов насамперед як атаман, а потім і гетьман Війська Запорозького. У перші роки XVII ст. П.Конашевич — один з організаторів і лідерів блискучих козацьких походів у татарсько-турецькі володіння. У 1601 р. запорожці прорвалися за Перекоп і здобули перемогу в Північному Криму. Того ж року вони на легких, маневрених човнах ("чайках") здійснили морський рейд у низов'я Дністра і Дунаю, наносячи удари по турецьких володіннях в Акермані (Білгород-Дністровський) та Ізмаїлі. Був похід і у підвладну турецькому султану Молдавію, після якого Сагайдачний на боці польських військ на чолі козацького загону брав участь у війні в Прибалтиці.
В усіх цих нелегких походах Петро Сагайдачний виявляв неабияку мужність і військово-організаційний талант. Його авторитет незмінно зростав і в 1605 р. його уперше обирають гетьманом Війська Запорозького. Тоді ж запорозькі козаки на чолі із Сагайдачним здійснили блискучий морський похід у Чорне море і взяли на болгарському узбережжі Варну — турецьке місто-фортецю, завдали серйозних ударів по Очакову і Перекопу. Успіхи принесли Сагайдачному загальноєвропейську славу. Запорозькі козаки, як і за часів Байди Вишневецького, зламали хід боротьби з турецько-татарськими силами в Північному Причорномор'ї на свою користь і відтоді аж до смерті уславленого гетьмана військова ініціатива незмінно була в їхніх руках. У 1609 р. під командуванням Сагайдачного запорожці на "чайках" знову вийшли в Чорне море і спалили турецькі міста-фортеці Ізмаїл, Килію та Акерман, звільнивши багатьох бранців. Проте повною мірою П.Сагайдачний не зміг скористатися здобутками своїх перемог. Через смуту в Московському царстві багато запорозьких, як і донських або терських, козаків шукали собі зиску і слави у військах самозванців — Лжедмитрія І і Лжедмитрія II, об'єдналися з лідером повстанців Болотниковим та ін. Участь у цих по суті грабіжницьких операціях значної частини українських козаків заважала закріпити досягнутий Сагайдачним успіх у Північному Причорномор'ї. Сам Сагайдачний у ці афери не вплутувався. Більше того, скеровані ним дії проти татар і турків об'єктивно йшли на користь Московській державі, оскільки загострювали стосунки між Османською імперією і Польщею. Проте кожний козак сам обирав, де, за що і з ким воювати. Польський король Сигізмунд III, що стояв за всіма цими авантюрами, мріяв підкорити Московське царство, посадивши на трон у Кремлі свого сина — королевича Владислава. Побоюючись війни з Туреччиною, він рішуче виступав проти дій запорозьких козаків у Причорномор'ї. Але його накази і погрози уже мало хвилювали козаків. Український народ в особі січового лицарства (а козаки в офіційних документах нерідко називали себе саме лицарями) сформував власні, цілком самостійні, збройні сили.
У 1612 р. Сагайдачний знову пішов на Кримське ханство. Розоривши Козлов (Гізлеу, теперішня Євпаторія), далі завдав удару по Кафі (Феодосія), що належала туркам, а за деякими відомостями, навіть узяв її. Саме в цей час Сагайдачний одержав звістку про вторгнення татарської орди на землі Поділля. Запорозький гетьман повернув свої війська на північ, підстеріг під Конськими Водами татар, що поверталися з України, і раптово напав на них. Запорожці заволоділи награбованим ханськими військами майном і звільнили полонених. Запорозькі удари по турецьких твердинях Причорномор'я відновилися після закінчення смути в Московській державі і притоку з півночі на Січ нових мас козаків. Справжнім тріумфом Війська Запорозького був морський похід 1614 р. на протилежний, південний берег Чорного моря. Сагайдачному вдалося взяти один із найбільших турецьких портових міст — Синоп, знищити місцевий гарнізон, звільнити християнських полонених і майже без втрат повернутися в Україну. У тому ж році був проведений і зухвалий, вельми вдалий наліт 80 запорізьких "чайок" на Стамбул. Козаки захопили і спалили дві столичні пристані, потім у бою з турецькою ескадрою захопити кілька галер, і за деякими даними навіть полонили турецького пашу (воєначальника). Але Сагайдачний не зупинявся на досягнутому і не давав ворогам перепочинку. У 1616 р. він очолив морський похід на Кафу, де був найбільший у Північному Причорномор'ї невільничий ринок. Козаки увірвалися у гавань, спалили турецький флот, оволоділи фортецею і звільнили величезну кількість бранців, які рознесли славу про доблесного гетьмана Східною і Центральною Європою. Останнім з узятих запорозьким гетьманом турецьких портів Причорномор'я було турецьке місто Трапезунд (Трабзон). Розлючений султан наказав стратити великого візира і багатьох своїх воєначальників. Завершальним акордом у цій переможній боротьбі був очолений Сагайдачним похід 1619 р. проти кримського хана. Головні сили запорожців протягом 20 років були спрямовані на боротьбу з Османською імперією і Кримським ханством. Король Сигізмунд III часто був незадоволений цим, але завадити діям козаків не міг. При всій незалежності запорожців, вони офіційно не відмовлялися від підданства Речі Посполитої і їм доводилося рахуватися з інтересами Варшави. Адже для боротьби з турками було потрібне своєчасне надходження продовольства, зброї і боєприпасів з українських міст, зайнятих королівськими гарнізонами. Крім того, у разі тотальної війни з Османською імперією (яка незабаром і почалася) зупинити ворога можна було лише спільними польсько-українськими силами. Тому Сагайдачний намагався домовитися з командувачем польських військ в Україні полководцем, коронним гетьманом Станіславом Жолкев- ським щодо козацьких повстань і не доводити ситуацію до відкритої війни з Польщею. Такою війною негайно б скористалася Туреччина, яка все ще мала потужний військовий арсенал. Компромісу було досягнуто при переговорах запорозького і коронного гетьманів у жовтні 1617 р. в урочищі Суха Ольшанка поблизу Білої Церкви. Поляки погодилися розширити козачий реєстр. У відповідь на це запорожці зобов'язувалися самовільно не нападати на Крим і турецькі володіння. Польська влада була зацікавлена в підтримці українського козацтва. Війна з Московською державою ще тривала, тому поляки мусили піти на істотні поступки в релігійному питанні. Король у принципі дав згоду офіційно визнати в межах Польско-Литовської держави юридично скасовану православну церкву з її ієрархією і земельними володіннями.
А от стосунки запорожців з урядом царя Михайла Федоровича Романова складалися не кращим чином. Зумовлювалося це передусім тим, що кремлівська адміністрація, вважаючи своїм головним ворогом Польщу, ввійшла в дружні стосунки з турками і кримськими татарами з наміром залучити їх до війни з королем Сигізмундом III. А це ставило під удари полчищ султана насамперед українські землі. Тому запорожці на чолі із Сагайдачним у перші роки правління царя Михайла опинилися в таборі його противників. У такому складному контексті міжнародних відносин стає зрозумілим і спільний похід польської армії під командуванням королевича Владислава (який згодом став королем Речі Посполитої) і запорозьких козаків на чолі із Сагайдачним на Москву в 1618 р. Королевич явно переоцінив свої сили і, підступивши до стін міста, не тільки не зміг ним заволодіти, а й потрапив у складну ситуацію. Сагайдачний підійшов до Москви вчасно. Йому вдалося врятувати польську армію і вивести Владислава з оточення. Цей епізод відіграв важливу роль у подальшому розвитку українсько- польських відносин. Затятий католик Сигізмунд III, на знак подяки Сагайдачному за порятунок сина, офіційно затвердив його гетьманом українського козацтва (тим самим фактично визнавши його реальну владу над переважною частиною Придніпровської України). Угода з коронним гетьманом Жолкевським у жовтні 1619 р. на річці Роставиця в містечку Паволоч ще більше зміцнила становище лідера запорожців. А втім польський уряд не бажав поступатися в релігійному питанні й не погоджувався з вимогою широких кіл української громадськості щодо відновлення офіційно скасованої Берестейською унією православної церковної ієрархії.
Вже на початку 1620 р., після повернення запорожців із Криму, обстановка розпалилася настільки, що козацтво, за підтримки київського духівництва, готове було вийти з польського підданства і стати на службу до царя Михайла. Умови такого переходу в тому ж році обговорював у Москві посол Сагайдачного Петро Одинець. У тому ж 1620 р., за рішучої підтримки киян і безпосередньої активної участі Сагайдачного, під охороною загонів запорожців, у Києві відповідно до церковних канонів було відновлено православну митрополію. Її очолив близький до гетьмана видатний церковний і культурний діяч, полеміст і просвітитель Іов Борецький.
Слід відзначити особисту участь гетьмана у створенні в Києві на Подолі при Братському Богоявленському монастирі колегіуму, що послугував основою для виникнення Києво-Могилянської академії: першого православного вищого навчального закладу європейського типу. Коли польська влада, а ще більш уніати, взялися заважати роботі цієї школи, Сагайдачний у 1616 р. особисто і з усім Військом Запорозьким записався до "братчиків". Цим жестом він поставив новостворений колегіум під збройний захист Січі.Проведена всупереч королівській волі акція з відновлення Київської православної митрополії призвела до різкого загострення стосунків між Варшавою і Запоріжжям. Проте тривало воно недовго. Починалася велика війна між Османською імперією і Річчю Посполитою, ареною якої могли стати землі України. У вересні 1620 р. турецьке військо завдало тяжкої поразки польській армії (у складі якого були й українські козаки, але без Сагайдачного) v Молдавії, на Цецорських полях. Тут, зокрема, героїчно загинули коронний гетьман Жолкевський і багато інших славнозвісних воїнів Польсько- Литовської держави, у тому числі й чигиринський підстароста Михайло Хмельницький, а його син Богдан (майбутній гетьман України) на три роки потрапив у турецький полон. Поразка на Цецорських полях відкрила ворогам шлях в Україну і татари скористалися цією можливістю. В жовтні 1620 р. буджацька орда жорстоко пограбувала Поділля. Тому погіри загострення українсько-польских відносин, обидві сторони в інтересах спільної оборони мусили шукати примирення й об'єднання сил. За умов, що склалися, польський уряд не міг собі дозволити конфронтації із Запоріжжям, а самі козаки добре усвідомлювали масштаб навислої над Україною загрози. У листопаді 1620 р. у Варшаві був скликаний державний сейм, на якому Сагайдачному, котрий прибув туди разом із представником відновленої православної ієрархії єпископом Йосипом Кунцевичем, вдалося переконати польську владу змиритися з відродженням Київської митрополії. Король дав офіційні обіцянки щодо якнайшвидшого "заспокоєння грецької віри". Дізнавшись про новий наступ величезного турецького війська у червні 1621 р. козацька рада в урочищі Суха Діброва, за участі православного духівництва і самого митрополита Іова Борецького, приймає рішення про негайний виступ запорожців і всього українського козацтва на допомогу польській армії, якою командував новий коронний гетьман Я.Ходкевич.
Об'єднані слов'янські війська (30 тисяч польських вояків і 40 тисяч українських козаків) на початку вересня 1621 р. зупинили майже 150-тисячні (за іншими відомостями — до 250 тисяч) турецькі полчища біля фортеці Хотин і впродовж місяця завдали їм низку поразок. Противник змушений був відступити на територію Молдавії. Небезпека турецького завоювання України була усунута, проте і втрати союзників виявилися значними. У боях під Хотином Сагайдачний був смертельно поранений. У важкому стані гетьмана на возі, наданому королевичем Владиславом, і в супроводі його особистого лікаря, привезли до Києва, де він, не піднімаючись з ліжка, прожив ще кілька місяців. Від його імені, від всього українського козацтва, міщанства і православного духівництва на початку 1622 р. у Варшаву на сейм вирушила делегація з вимогою скасування унії і цілковитого визнання відновленої півтора роки раніше Київської митрополії. Король був готовий піти на це, та депутати сейму, під впливом католицької ієрархії, заблокували прийняття відповідної постанови.
Сили вже літнього гетьмана кінчалися. 10 квітня 1622 р. він помер в оточенні соратників і друзів. У своєму заповіті Петро Конашевич-Сагайдачний переказав особисте майно на потреби Київської і Львівської православних братських шкіл, церквам і монастирям України. Його смерть була сприйнята православною церквою і запорозьким козацтвом, киянами і всім українським народом як гірка втрата. Поет і ректор Київської братської школи Касіян Сакович склав на честь покійного гетьмана величні й зворушливі вірші, які на похороні по черзі декламували дванадцять студентів. Поховали героя у Богоявленському соборі Київського братського монастиря біля будинку облагодіяної ним братської школи.