XVI сторіччя в історії України мало особливе значення. Це був час завершення формування укра­їнського народу, що складався головним чином із нащадків князівств Південної і Південно-Західної Русі: Київського, Чернігівського, Новгород-Сіверського, Переяславського, Галицького і Волинського. На межі XV—XVI ст. на території лісостепової України, переважно в Середній Наддніпрянщині, значно прискорюється процес етнічної консоліда­ції. Це стимулювалося насамперед трьома жорсто­кими "викликами" з боку зовнішніх сил. По-перше, татарсько-турецькою агресією, що загрожувала фізичною розправою жителями українських земель; по-друге, польською експансією в Україні, що вела до закріпачення се­лян та козаків і супроводжувалась утисками православної шляхти, духів­ництва; по-третє, церковно-культурним тиском католицького духівниц­тва при поширенні влади папства на значну частину українських земель унаслідок Берестейської церковної унії 1596 року.

На тлі процесів національної консолідації в Україні й розгорталася ді­яльність двох представників династії князів Острозьких, батька — Кос­тянтина Івановича і його сина — Костянтина-Василя Костянтиновича.

Вважається, що рід князів Острозьких походить від поліської гілки династії Рюриковичів. Костянтин Іванович Острозький (1460 або 1463— і 1530) — староста Поділля, гетьман Великого князівства Литовського, видатний полководець, політичний діяч і меценат. Він прославився насамперед тим, що зумів домогтися перелому у війні з кримськими татарами, і застосувавши нову, винайдену ним тактику ведення бойових дій. На во­рога нападали, коли той повертався, обтяжений здобиччю і бранцями, втративши мобільність і маневреність.

Літописці стверджують, що Костянтин Іванович одержав перемоги в 60 битвах. Вражаючими були бої з татарами 1512 року під Вишневцем на Волині та 1527 року під Ольшаницею на Київщині. Натиск татар було зупинено, а спустошені ними південні райони Поділля та Середньої Наддніпрянщини знову почали заселятися. Славу Острозькому принесла перемога над військами великого князя Московського Василя III під Оршею в 1513 році. За умов католицького впливу, що дедалі зростав, Костянтин Івано­вич — ревнитель християнської віри східного обряду — очолював правос­лавну "партію", надавав матеріальну й політичну підтримку розвиткові  церковно-культурного життя в Україні. Саме він боровся за відновлення і духовної величі Києво-Печерської лаври. Захоплені відгуки про Острозького-старшого залишили не тільки православні літописці, а й польські автори. Останні відзначали в нього одну-єдину ваду: те, що він був "схизматом", тобто православним.

Не менше за батька, але вже не стільки ратними подвигами, скільки меценатством і культурно-просвітницькою діяльністю відзначився його | син і спадкоємець Костянтин-Василь Костянтинович Острозький. Він був одним із найвпливовіших військово-політичних діячів Речі Посполитої (федеративної держави, що виникла у 1569 році в результаті об'єднан­ня Королівства Польського та Великого князівства Литовського). Понад три десятиліття, з 1576 року й до самої смерті Острозький-молодший очо­лював Київське воєводство. На високій посаді київського воєводи Костянтин-Василь протистояв татарським набігам, активно залучаючи до оборони ще розрізнені й мало і організовані козацькі загони. Проте головною його заслугою була невтомна боротьба за збереження й розвиток православної культури на українських землях за умов утисків, а потім і неприкритих гонінь із боку католицької церкви та посталої після Берестейського собору 1596 року уніатської ієрархії.

Князь був різнобічно освіченою людиною, володів кількома мовами  й добре розумівся на основах православного, католицького та протестантського богослов'я. Усвідомлюючи значення науки, просвітництва і друкарства, він на власні кошти заснував в Острозі греко-слов'яно-латинську колегію (яку називали також академією). Це був перший на східнослов'янських землях навчальний заклад європейського типу. Твердження єзуїтів про неможливість розвивати вищу освіту на засадах православ'я було спростовано. При Острозькій школі зібрався гурток високоосвічених православних різних національностей. Були серед них греки, які вже здобули вищу освіту в університетах Західної Свопи (Никифор Лукарис — згодом патріарх), але переважали українці та білоруси. Найшанованішими серед них були богослови і філологи Герасим Смотрицький та його син Максим (більше відо­мий під своїм чернечим ім'ям Мелетій), церковні полемісти Іван Вишенський і Ва­силь Красовський, письменник і вчений Дем'ян (Даміан) Наливайко, старший брат Северина Наливайка — сотника надвірної корогви князя Острозького, який став ле­гендарним ватажком козацького повстання 1595-1596 років. До кола друзів Костянтина-Василя Острозького входив і князь Андрій Курбський, який утік із Московського царства від звірств Івана Грозного. Він відзначав­ся особливою начитаністю й гострим ро­зумом. У 1575 році на прохання Костянти­на-Василя зі Львова до Острога переїхав відомий першодрукар Іван Федоров (в Ук­раїні відомий також як Федорович), котрий теж мусив покинути Москву. Він був запрошений для роботи в заснованій (а ймовірніше — відновленій) у 1571 році Костянтином-Василем друкарні. Покладаючись на вчених і просвітителів, які зібралися довкола нього, князь задумав грандіозну справу — видання Біблії церковнослов'янською мовою. На той час уже існували переклади окремих книг Старого й Но­вого Заповітів, які йшли ще від першовчителів слов'янства Кирила та Мефодія. Проте зберігалися ці переклади в поодиноких рукописних примір­никах у різних куточках православно-слов'янського світу, рясніли допущеними перекладачами й переписувачами неточностями і явними помилками, містили різночитання, що спотворювали тлумачення Свято­го Письма. При цьому багатьох важливих біблійних текстів у слов'янсь­кому варіанті не існувало взагалі і їх варто було перекласти з грецької з урахуванням уже наявного латинського перекладу.  Князь енергійно взявся за організацію видання Біблії. На його осо­бисті гроші були відправлені до різних міст люди, що провадили пошуки біблійних грецьких текстів і слов'янських перекладів. Оригінали чи копії везли в Острог, де їх звіряли, редагували і зводили в єдину церковнос­лов'янську книгу, яка одержала назву "Острозька Біблія". Оздоблену ви­сокохудожніми гравюрами, її було видрукувано в 1581 році.

Видання "Острозької Біблії" за умов польсько-католицького тиску і невтішного стану православ'я загалом (після розорення монголами кня­зівств Русі та загибелі під ударами хрестоносців і турків Візантії) було культурно-просвітницьким подвигом. Слов'яни східного обряду отримали справжні біблійні тексти зрозумілою їм мовою. Виконану роботу за її зна­чущістю можна порівняти з перекладом і публікацією Біблії німецькою мовою, що їх на півстоліття раніше здійснив Лютер.

Примірники "Острозької Біблії" почали швидко розходитися україн­сько-білоруськими землями Речі Посполитої, потрапляючи іноді й до Московського царства, а також до болгар і сербів, що перебували під вла­дою Туреччини. Цим виданням широко користувалися православні арис­тократи й церковнослужителі. Проте особливу роль "Острозька Біблія" відігравала в демократичному середовищі православних братств, які масо­во виникали в містах України та Білорусії у другій половині XVI століття. Найчисельнішим і найвпливовішим вважалося Львівське братство, а з по­чатку XVII століття — Київське. Саме братства стали осередками правос­лавної освіченості, мали школи й навіть бібліотеки.

Діяльність Острозької друкарні не обмежувалася виданням тільки Біб­лії, в ній працювали над різноманітною релігійною та навчальною літера­турою. 1587 року в Острозі видається перша полемічна, спрямована на за­хист православної віри від нападок із боку католиків, праця Герасима Смотрицького "Ключ царства небесного", а невдовзі — "Книжиця" Ва­силя Сурозького аналогічного ідейного спрямування.

Особлива роль належить князю Костянтину Костянтиновичу в бо­ротьбі з запровадженням унії на українсько-білоруських землях кінця XVI—початку XVII століть.

Берестейська унія 1596 року готувалася таємно від православної гро­мадськості, її прийняття "князями церкви" було для основної маси не тіль­ки парафіян, а й багатьох священиків та ченців Повною несподіванкою. Унія внесла розбрат в українсько-білоруське суспільство у найвідповідаль­ніший момент його історії. Водночас польська влада створила умови для покатоличення представників вищих верств українського суспільства, на­давши шляхті латинського обряду права, якими була обділена шляхта пра­вославна (скажімо, бути обраними на вищі урядові посади — воєвод і каш­телянів, — а отже, засідати в сенаті й реально бути серед перших людей Речі Посполитої, впливаючи на її політику).

У ситуації всебічного тиску на віруючих візантійського обряду князь Костянтин Острозький виявився серед найстійкіших православних арис­тократів і державних діячів Речі Посполитої вищого рангу, які виступили проти унії (окрім нього ще були князі Збаразькі, Друцькі-Соколинські, Корецькі та ін.; цікаво, що в неправославному середовищі унія так само не скрізь знайшла підтримку: проти неї виступили деякі державні діячі з числа римо-католиків і протестантів). Особливе обурення князя викли­кало таємне, без обговорення православною громадськістю, її укладення.

У широко розповсюдженому листі князь проголосив ініціаторів унії "вовками в овечій шкурі", що зрадили свою паству, й закликав віруючих до відкритих виступів. Костянтин Острозький надіслав офіційний протест королю Сигізмунду III, але той його проігнорував. Тоді князь вступив у анти католицький союз із польськими протестантами, погрожуючи під­няти збройне повстання. Під його впливом шляхта, що залишилася вір­ною православ'ю (частина її вже входила до лав козацтва), збиралася на повітові сейми, де виступала протїі унії. Провідні монастирі і насамперед Києво-Печерська лавра, очолювана ревнителем православ'я Ничипором Туром, також рішуче висловили неприйняття унії, піддавши прокляттю її ініціаторів.

Цими рішучими діями Костянтину Острозькому разом із друзями і сподвижниками (Ничипором Туром, Іваном Вишенським, острозьким шляхтичем Мартином Броневським, що писав під псевдонімом Христо- фор Філалет) вдалося значною мірою зірвати плани приведення до стану унії всього українсько-білоруського православ'я. В 90-х роках XVI століт­тя в Україні з'являється цілий напрям релігійно-полемічної літератури, що сягнув свого розквіту в наступні десятиріччя.

Проте на православних землях польсько-литовської держави можли­вості протистояти уніатству й католицькому натиску були не в усіх одна­ковими. У найближчій до Польщі Галичині та на переважній частині Во­лині позиції католицизму наприкінці XVI століття були досить сильними і влада належала католикам, у тому числі з вельможних західноукраїн­ських родів. А в Середній Наддніпрянщині польсько-католицький вплив був малопомітний. Одна з причин — посаду київського воєводи зберігав за собою Костянтин Острозький. Це не дозволяло уніатам широко (як у Галичині або Литві) починати в Києві й окрузі насильницькі дії проти православних. Підпорядкуванню папі тут рішуче противилися, особливо духівництво, козаки й городяни.

Варто сказати і про меценатську діяльність князя Острозького в під­тримку православної церкви. У Києві завдяки його клопотанням і мате­ріальній підтримці були відновлені Кирилівський і Межигірський монас­тирі, досягла розквіту Києво-Печерська лавра, були споруджені церкви Миколи Доброго й Різдвяно-Предтечинська на Подолі. Згідно з перека­зами, Костянтин Острозький був патроном понад 1000 православних цер­ков по всій Україні. Меценатство, видавнича діяльність і політичне заступництво Костян­тина Острозького, його невтомна просвітницька робота допомогли укра­їнському православ'ю вистояти і зміцніти. Однак процес покатоличення й полонізації українсько-білоруської аристократії набував незворотного характеру. В католицизм переходили колись найвідоміші православні княжі родини. Більше того, ще за життя Костянтина-Василя його діти теж перейшли в католицизм, вірним правос­лав'ю залишився тільки син Олександр, але він помер раніше за батька.

У XVII столітті на авансцену української історії виходять нові соціаль­но активні сили, що зберегли вірність православ'ю, — городяни (міщани), духівництво, головним чином Києва, а також запорозьке козацтво, яке поступово перетворювалося на грізну воєнну силу.